Die Eberstadter Höhlenwelten entwickeln sich im Unteren Muschelkalk, dem so genannten Wellenkalk. Er bildete sich vor rund 235 bis 243 Millionen Jahren, als das heutige Festland Mitteleuropas von einem flachen Meer bedeckt war. Vorwiegend Muschelschalen sowie am Meeresboden abgelagerte Skelette und Panzer von Meerestieren bauten das Gestein mit seinem sehr hohen Kalkgehalt und seiner hellgrauen bis gelblichen Farbe auf. Weitere Ablagerungen von mehreren hundert Metern Mächtigkeit sorgten dafür, dass der Wellenkalk verdichtet und verfestigt wurde. 

Vor rund 45 Millionen Jahren begann der Oberrheingraben durch weiträumige Bewegungen in der Erdkruste einzusinken. Die Grabenränder wurden entgegengesetzt dazu hochgedrückt und die Flanken gekippt, so dass die übereinander lagernden Gesteinsschichten hier nach Südosten einfallen. Mit der Heraushebung ging gleichzeitig die Verwitterung und Abtragung der verschiedenen Gesteinschichten einher. Im östlichen Odenwald ist die Abtragung bis in die Schichten des Buntsandsteins vorangeschritten. Im Bauland wurde das darüber lagernde Paket des Muschelkalks freigelegt.

Nicht zuletzt das Einsinken des Oberrheingrabens verursacht Spannungen in den Gesteinen, es entstehen Risse, Klüfte und Verwerfungen. Spätestens als der Muschelkalk schließlich hier zur Erdoberfläche wurde, konnte das Wasser auf diesen Wegen in tiefere Schichten gelangen und Höhlen bilden.

Die Lösung des Kalkgesteins kann jedoch nur dadurch voranschreiten, dass Sickerwasser mit Kohlenstoffdioxid angereichert ist. Dieses wird vom Regenwasser aus der Luft oder beim Durchsickern der Bodenschichten aufgenommen, die durch Pflanzen und Bodenorganismen über einen relativ hohen Kohlenstoffdioxidgehalt verfügen. Kohlenstoffdioxid verbindet sich mit Wasser zu Kohlensäure, die Kalk lösen kann.

Aus feinen Rissen im Gestein entwickeln sich durch Einwirkung von Kohlensäure über längere Zeiträume Röhrensysteme und größere Hohlräume. Hat das Höhlensystem bereits größere Ausmaße und liegt es im Bereich oder oberhalb des Grundwasserspiels, erreicht die Höhle das Stadium der Flusshöhle. Die Eberstadter Tropfsteinhöhle befindet sich mittlerweile im nächsten Stadium - der Höhlenboden wird nicht mehr von einem Bach durchflossen sondern ist größtenteils trocken gefallen, da der Grundwasserspiegel heute tiefer liegt.

Sobald die Höhle kein vollständig mit Wasser gefülltes Röhrensystem mehr ist sondern vielmehr von einem Bach durchflossen wird und darüber ein Luftraum existiert, kann die Bildung von Tropfsteinen einsetzen. Beim Eintritt in die Höhlenatmosphäre entweicht nämlich dem Sickerwasser, das durch Risse an der Decke und den Wänden der Höhle eindringt, Kohlenstoffdioxid. Dadurch verringert sich die Kapazität, Kalk zu lösen. Bereits gelöster Kalk fällt aus und baut Tropfsteingebilde unterschiedlichster Formen auf.